管理規(guī)范：通過ISO9001:2015質(zhì)量管理體系認(rèn)證；
質(zhì)量可靠：上下游實驗均采用磁珠純化，實驗穩(wěn)定結(jié)果更好；
菌液樣品需要注明抗性，如果需要特殊抗性搖菌請在送樣時一起送來公司，并告知工作濃度（本公司目前只Amp，Kan，Cm，Tc四種抗生素）；
需要測序的引物不是通用引物時，請單獨提供，并標(biāo)注濃度；
送樣管上編號請和登記單上保持一致，樣品編號可包含“字母”、“數(shù)字“—”，請勿出現(xiàn)其他特殊字符；
快速交付：質(zhì)粒樣品最快8小時出具結(jié)果，且有完善的LIMS系統(tǒng)，可以實時跟進(jìn)實驗進(jìn)度以及結(jié)果的在線下載；
Sanger測序服務(wù)作為諾賽基因經(jīng)典項目，從1998年承擔(dān)國際人類基因組計劃中國區(qū)1%測序任務(wù)至今，其間承接多項國家級重大項目。業(yè)務(wù)涉及生物學(xué)各領(lǐng)域，包括DNA測序、RNA測序、甲基化測序等服務(wù)。諾賽基因擁有世界一流的儀器設(shè)備、超過20年對外測序服務(wù)經(jīng)驗、標(biāo)準(zhǔn)化的測序流程、全程監(jiān)控的質(zhì)量保障和質(zhì)量控制系統(tǒng)，本著“客戶第一、服務(wù)至上”的企業(yè)宗旨，致力于為客戶提供高質(zhì)量、高性價比、高效率的測序服務(wù)。
???樣品類型 | 濃度 | 體積（最少量） | 長度 | 備注 |
PCR原液 | 1ul電泳檢測應(yīng)為明亮的一條帶（≥20ng/ul） | ≥30ul | 100bp~3k | 5ul/反應(yīng) |
已純化PCR產(chǎn)物 | ≥10ng/ul | 10ul | 100bp~3k | 5ul/反應(yīng) |
質(zhì)粒 | ≥50ng/ul | 10ul | 插入＜6k | 5ul/反應(yīng) |
菌液 | 甘油菌和剛接種的菌液請注明 | 50ul | 插入＜6k | 只接收大腸桿菌；需注明載體和抗性，特殊抗性請自備并注明用量；對于拷貝數(shù)低和大的質(zhì)粒載體，請自行提供質(zhì)粒測序 |
1. 建議PAGE純化測序引物；
2. 引物濃度不低于5 pmol/ul，不少于10ul。樣品較多或反應(yīng)數(shù)多時需多提供，正常情況下，按1ul/個反應(yīng)計算；
3. 引物長度一般在18-23bp比較適合測序，引物Tm=50~60℃，18~25mer，GC含量40~60%。無四個以上連續(xù)堿基，尤其3’端；
4. 隨機(jī)引物（RAPD引物）和簡并引物，混合引物以及引物長度不足17bp或大于35bp的不建議用于測序；
5. 勿使用有熒光標(biāo)記或其它標(biāo)記的引物；
人員穩(wěn)定：服務(wù)平臺的重要崗位人員均具有多年經(jīng)驗，有效降低實驗過程中的人為誤差；
請詳細(xì)填寫諾賽基因DNA測序登記單，為避免產(chǎn)生問題訂單，大批量的樣品請?zhí)峁╇娮影鏈y序登記單；
測序通量：擁有多臺3730xl測序儀,可滿足大批量測序要求；
測序樣品存在特殊結(jié)構(gòu)，請在訂單上備注，如：GC rich大于70%、甲基化、復(fù)雜結(jié)構(gòu)等；
1. 接收樣品當(dāng)天不計算在內(nèi)，12-48小時內(nèi)發(fā)送測序結(jié)果；
2. 測序結(jié)果我們以壓縮文件Zip形式發(fā)送，內(nèi)含測序結(jié)果和《DNA測序報告》，其中：
A．a(chǎn)b1為后綴的文件為測序圖譜，可使用CHROMAS, BIOEDIT, DNAMAN 等軟件打開；
B． Seq為后綴的文件為堿基序列，可使用NOTEPAD(記事本)或者DNAStar等軟件打開；
C．《DNA測序報告》為HTML文件，可使用Internet Explorer等網(wǎng)絡(luò)瀏覽器打開，該報告包含樣品測序的詳細(xì)信息，同時作為我公司與您對測序服務(wù)交流的重要書面材料，請認(rèn)真查看；
3. 如需對您的樣品測序進(jìn)行實時跟蹤和結(jié)果下載, 請登錄http://61.49.28.136/web, 輸入用戶名和密碼，即可進(jìn)入頁面進(jìn)行測序跟蹤和結(jié)果下載；
4. 典型的峰圖；
電話訂購：010-67873039/4478；李經(jīng)理：13522520637；王經(jīng)理：15210696931
相關(guān)資料：諾賽基因DNA測序登記單；
1.為什么過短的PCR產(chǎn)物不適于直接測序？
首先，測序的引物是沒有熒光標(biāo)記的，所以我們測的序列是從引物后面的堿基開始的，同時由于引物后面30至50bp堿基測序不準(zhǔn)確，考慮到后續(xù)有效序列比對的問題，所以建議用于測序的PCR產(chǎn)物的長度一般不低于150bp；其次，過短的PCR產(chǎn)物純化比較困難，所以建議PCR產(chǎn)物片段不低于150bp；再次，太短的PCR產(chǎn)物測序受外界的干擾比較大，很容易造成測序失敗或不理想；綜上所述，我們建議用于測序的PCR產(chǎn)物的長度一般不低于150bp。如低于150bp建議您重新設(shè)計擴(kuò)增引物或是克隆后再測序。
2.DNA片段很長，一個反應(yīng)測不到頭，怎么辦？
可以分別用兩端引物進(jìn)行雙向測序，讓其中間部分的序列交叉互補(bǔ)，便可完全測通。如果這樣還測不通，可在已經(jīng)測出序列的500～700個堿基處設(shè)計測序引物做進(jìn)一步測序（即Primer Walking），直至完全測通。
3.為什么在primer walking時總將引物設(shè)計得那么靠前？
我們在設(shè)計引物時有兩個準(zhǔn)則。一是用于設(shè)計引物的序列必須準(zhǔn)確，二是在引物區(qū)之后還必須有足夠的準(zhǔn)確序列用于拼接。這樣我們設(shè)計引物的位置就必然在已測序的準(zhǔn)確序列的末尾之前一段位置上，在滿足軟件設(shè)定的條件下，我們總會選取最靠近3’端的引物來作為最終的測序引物。
4.我有一個4KB的PCR片段，希望你們幫我測通。
大于3KB的PCR片段要測通最好是構(gòu)建到載體上再進(jìn)行測序。這樣模板更加穩(wěn)定，測序效果也更好一些。
5.PCR片段直接測序和PCR片段經(jīng)克隆后測序的結(jié)果有何區(qū)別？
眾所周知，PCR擴(kuò)增過程中會出現(xiàn)錯配現(xiàn)象，但所有錯配都發(fā)生在同一位置的概率極低。PCR片段直接測序時，測得的是PCR產(chǎn)物眾多分子混合物的結(jié)果。若某一個位點上極少的一些PCR產(chǎn)物(約幾十個分子)在該位點上存在錯配，但大多PCR產(chǎn)物（約幾十萬個分子）在這個位點上還是正確的，因此測序時，錯配現(xiàn)象是反映不出來的。而PCR片段經(jīng)克隆后測序是測定某一個PCR產(chǎn)物分子的DNA序列。在幾十輪循環(huán)的PCR擴(kuò)增過程中，很難保證某一個分子的任何位點都不發(fā)生錯配。因此，PCR片段經(jīng)克隆后的測序結(jié)果，往往存在著一些錯配的序列，和PCR片段直接測序的結(jié)果相比有些堿基會有所不同。這種錯配現(xiàn)象的多少取決于PCR擴(kuò)增時使用的DNA聚合酶的保真性能。要減少PCR擴(kuò)增過程中的錯配現(xiàn)象，在PCR反應(yīng)時選用保真性能高的DNA聚合酶。
6.我測得的基因序列為什么與標(biāo)準(zhǔn)序列有差別？
原因可能是：
①PCR擴(kuò)增過程中產(chǎn)生錯誤；
②載體擴(kuò)增或保存過程中發(fā)生突變；
③ABI公司承諾其儀器的測序精度是≧98.5%。
解決措施有：
①排除模板、PCR擴(kuò)增或載體相關(guān)的錯誤；
②雙向測序。
7. 我要求5’到3’正向測序，為什么你們給我的序列是反的？
我們是按照您所選擇的引物來測序的，有可能該序列與您手中資料上的序列的方向相反，也可能是目標(biāo)片段的插入方向與您預(yù)期的相反。填寫測序要求時，請不要使用3’引物和5’引物這樣的字樣，而應(yīng)以T7，T3，SP6，M13f，M13r等形式來填寫，或注明酶切位點方向比如“測序方向Eco RI到Hind Ⅲ”。如果您提供的載體比較特殊，還需要您提供質(zhì)粒的相關(guān)圖譜等資料和信息。
8. 為什么找不到我的PCR引物？
有以下幾種情況，我們將無法找到PCR引物序列：
（1）用PCR引物作為測序引物進(jìn)行測序時，所測序列是從引物3’末端后第一個堿基開始的，所以找不到測序引物的序列。有兩種方法可以得到測序引物序列。①對于較短的PCR產(chǎn)物（〈800bp），可以用另一端的引物進(jìn)行測序，一直測到序列的末端，就可以在序列的末端找到您的引物的反向互補(bǔ)序列或是在已測出的結(jié)果200bp左右設(shè)計反向引物，也可以在序列的末端找到您的引物的反向互補(bǔ)序列。②對于較長的序列，一個測序反應(yīng)測不到頭，可以將您的PCR產(chǎn)物克隆到適當(dāng)?shù)妮d體中（比如T載體），用載體上的通用引物進(jìn)行測序。由于載體上的通用引物與插入序列之間還有一段距離，因此就可以得到您的完整的引物序列。由于在測序的起始端總會有一些堿基無法準(zhǔn)確讀出，因此，您如果想得到您的PCR產(chǎn)物的完整序列，最好克隆后進(jìn)行測序。
（2）PCR產(chǎn)物用T載體克隆后，由于克隆的方向是隨機(jī)的，因此，當(dāng)您在一條鏈上找不到您的引物序列時，試圖在互補(bǔ)鏈上尋找您的引物序列。
（3）當(dāng)測序引物離您的插入片段很近時，有時可能也無法找到您的引物的全序列。這主要是因為一代測序是測引物后面的序列，由于引物后面30~50個堿基測序不準(zhǔn)確或起始端有未去除的染料或引物二聚體的干擾，造成起始區(qū)的序列不好，可能無法找到您的引物完整序列。
（4）有時，質(zhì)粒做模板進(jìn)行測序時，由于某些原因，質(zhì)粒上沒有插入外源目標(biāo)片段，或為空載體，所測的序列完全為載體序列，此時自然也找不到引物序列。
9. PCR測序后面很多雜信號？
PCR產(chǎn)物直接進(jìn)行測序，序列結(jié)束后無反應(yīng)信號。PCR產(chǎn)物測序一般末端的一個堿基為A（綠色峰），這是由于Taq酶能夠在PCR反應(yīng)的末端非特異性地加上一個A堿基，我們用T載體克隆PCR產(chǎn)物就是根據(jù)該原理的，這樣我們很容易辨別PCR產(chǎn)物結(jié)束的位點。在此序列以外就不是我們所需要的序列了。
10. 測序結(jié)果不到700bp還照常收費了，為什么？
如果樣品的DNA序列分布勻稱，沒有復(fù)雜結(jié)構(gòu)，正常的測序反應(yīng)能保證達(dá)到700bp以上。但有一些DNA樣品立體結(jié)構(gòu)復(fù)雜，造成聚合酶延伸反應(yīng)終止，測序信號突然減弱或消失，或者測序結(jié)果出現(xiàn)套峰現(xiàn)象。出現(xiàn)這些現(xiàn)象的原因由DNA模板本身所造成。對這些結(jié)果，諾賽會根據(jù)具體情況收取費用。
出現(xiàn)這些情況的原因分析如下：
（1）G/C rich、G/C Cluster：這種情況一般表現(xiàn)為測序信號突然減弱或消失；
（2）A、T的連續(xù)結(jié)構(gòu)：這種情況一般表現(xiàn)為A、T連續(xù)結(jié)構(gòu)后面的測序結(jié)果出現(xiàn)套峰。根據(jù)文獻(xiàn)記載，原因在于聚合酶進(jìn)行聚合反應(yīng)時，由于A或T的連續(xù)，聚合酶難以識別完整的每個A或T，在某個A或T的后面便開始進(jìn)行A或T連續(xù)結(jié)構(gòu)以后序列的聚合反應(yīng)（打滑現(xiàn)象），造成測序結(jié)果紊亂，出現(xiàn)套峰。出現(xiàn)這樣的情況，建議反向測序；
（3）原因不明的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，測序結(jié)果出現(xiàn)信號突然減弱或消失。這種情況一般表現(xiàn)為已測出部分DNA堿基排列并無特別異常，從某一位置開始聚合酶的聚合反應(yīng)便無法進(jìn)行，測序信號突然減弱或消失。
11. 我的樣品你們已經(jīng)測通了，但為什么在overlap區(qū)有這么多的錯配，給出的全序列和單個報告也稱作差異，我該相信誰？
給出的全序列是一個拼接的結(jié)果，當(dāng)互相拼接的兩個序列存在差異時，應(yīng)該以序列質(zhì)量更好為主。
12. 我的樣品送測序前已經(jīng)鑒定過了，有插入片段的，為什么你給我的測序結(jié)果是一個空質(zhì)粒？
鑒定過程中出現(xiàn)的假陽性。鑒定插入片段主要是通過PCR和酶切兩種方式鑒定。由于PCR反應(yīng)受多種條件的影響，在鑒定過程中易產(chǎn)生假陽性，而酶切鑒定是比較可靠的鑒定方式。
13.測序完成后，測序樣品和引物將如何處理（或保存）？
客戶需要將測序樣品或引物（客戶自帶的）返還時，我們在測序完成的同時，按客戶要求返還樣品或引物（客戶自帶的）。對于未要求返回的測序樣品及隨工引物，如無特殊要求，公司負(fù)責(zé)保存3個月（菌類樣品保存1個月），我們將不再通知到期直接銷毀，如后續(xù)仍需安排實驗，請重新提供。
14.測序結(jié)果可以用哪些軟件打開？
（1）ab1格式的峰圖打開軟件有Sequence Scanner、DNASTAR、FinchTV、Chromas…；seq格式的序列軟件除了以上的之外還可以直接用文本格式的記事本直接打開；
（2）序列拼接軟件Seqman、ContigExpress…
北京諾賽基因組研究中心有限公司
客服：010-67883332
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